抗坏血酸过氧化物酶(APX;EC 1.11.1.11)也称维生素C过氧化物酶,是植物细胞中防御外界氧化胁迫和植物本身活性氧代谢的重要抗氧化酶类。它在降低H₂O₂对植物细胞产生氧化损伤方面起关键作用。
定义与功能:
APX是植物活性氧代谢中重要的抗氧化酶之一,特别是叶绿体中清除H₂O₂的关键酶。H₂O₂是植物叶绿体中光合电子传递链和某些酶反应的天然产物,是具有毒害作用的活性氧。APX通过催化H₂O₂的分解,保护植物细胞免受氧化损伤。
APX还是维生素C代谢的主要酶类,参与抗坏血酸(AsA)的氧化还原循环。
反应过程:
APX首先与H₂O₂形成中间复合物。
中间复合物接着氧化AsA,形成单脱氢抗坏血酸(MD-AsA)和水。
当AsA未被复合物利用时,APX失活。因此,适当浓度的内源AsA对于APX的稳定性是至关重要的。
酶活性测定:
APX与AsA具有一定的负相关性。通过测定AsA的氧化速率,可以计算APX的酶活性。
酶活性通常以每克组织每分钟氧化1μmol AsA为一个酶活单位(U)来表示。
生理意义:
APX在植物细胞中的抗氧化防御系统中扮演重要角色,有助于植物应对各种生物和非生物胁迫。
APX的活性受到多种因素的影响,包括光照、温度、水分状况等。
进行APX酶活性测定实验时,需要以下仪器和用品:
酶标仪:
用途:用于测量AsA在特定波长(如290nm)下的吸光度变化,从而计算AsA的氧化速率和APX的酶活性。
注意事项:在使用前需要预热并校准酶标仪,确保测量结果的准确性。
96孔板(UV板):
用途:用于盛放待测样品和试剂,便于高通量测定。UV板具有良好的透光性,适合在紫外光下测量吸光度。
注意事项:在使用前需要确保96孔板干净无污染,并且样品和试剂的加入量要准确。
低温离心机:
用途:用于分离样品中的固体和液体成分,提取APX酶液。低温条件有助于保持酶的活性。
注意事项:在使用前需要设置好离心参数(如转速、时间等),并确保离心机已预冷至适当温度。
移液枪:
用途:用于精确移取样品和试剂,确保实验结果的准确性。
注意事项:在使用前需要校准移液枪,并避免气泡和溅出。
研钵:
用途:用于研磨植物组织,释放APX酶。
注意事项:在使用前需要确保研钵干净无污染,并在研磨过程中加入适量的液氮或冰以保持低温环境。
冰:
用途:用于在样品处理过程中保持低温环境,防止酶失活。
注意事项:在使用前需要确保冰的干净无污染,并及时更换以保持低温环境。
蒸馏水:
用途:用于配制试剂和稀释样品。
注意事项:在使用前需要确保蒸馏水的纯度,并避免污染。