小鼠犬尿氨酸(KYN) ELISA

小鼠犬尿氨酸(KYN) ELISA 说明书（高）.pdf

一、产品基本信息

产品名称：小鼠犬尿氨酸（KYN）酶联免疫吸附测定试剂盒（竞争法）
规格：48T/96T
检测原理：本试剂盒采用竞争抑制酶联免疫吸附法（ELISA），基于样本中KYN与固定化抗原竞争结合有限量特异性抗体的原理，定量检测小鼠血清、血浆、细胞培养上清及组织匀浆中的KYN浓度。
反应类型：竞争法
反应时间：约3.5-4.5小时
反应性：高度特异，仅针对小鼠KYN，与其他色氨酸代谢物（如5-HT、KYNA）及芳香族氨基酸（如Trp、Phe）无显著交叉反应。
检测方法：比色法（测定波长450 nm，参考波长620 nm）
灵敏度：最低检测限≤5 ng/mL，可定量检测低至2 ng/mL的KYN水平。
样本体积：50 μL-100 μL
样本类型：血清、血浆（EDTA/肝素抗凝）、细胞培养上清、组织匀浆。
特异性：与犬尿喹啉酸（KYNA）、色氨酸（Trp）、5-羟色胺（5-HT）交叉反应率＜0.1%。
重复性：板内及板间变异系数（CV）均＜10%，确保结果可靠性。

二、样品处理指南

血清/血浆样本

1. 血液采集后，3000 rpm离心10分钟分离血清或血浆（抗凝剂推荐EDTA或肝素）。

2. 吸取上清液时避免吸入细胞成分或血小板。

3. 分装至洁净离心管，标注样本信息，长期保存需置于-80℃（避免反复冻融≤3次）。

细胞培养上清液

1. 收集对数生长期细胞上清，确保无细胞污染或代谢抑制。

2. 轻柔混匀后，用无菌吸管吸取上清，避免吸入细胞或碎片。

3. 分装样本并标注细胞类型及培养条件，短期保存（≤3天）可置于4℃，长期保存需-80℃冷冻。

组织匀浆

1. 切割组织（去除脂肪、血管等杂质），称取50-100 mg样本。

2. 按1:10（w/v）加入预冷PBS或专用裂解液，冰浴匀浆。

3. 12000 rpm离心15分钟，收集上清液，分装并标注组织类型及处理条件。

三、精密度与回收率

• 精密度：通过低、中、高浓度样本的批内及批间测试，CV均＜8%。

• 回收率：在血清、血浆、细胞培养上清及组织匀浆中添加已知浓度KYN标准品，回收率范围为95%-105%，线性相关系数R²＞0.99。

四、试剂盒组成及保存

48孔配置

• 说明书 ×1

• 封板膜 ×2

• 密封袋 ×1

• 酶标包被板（48孔，预包被抗KYN抗体） ×1

• KYN标准品（0.3 mL×6管，浓度：0、10、25、50、100、200 ng/mL）

• 酶标试剂（HRP标记KYN-BSA复合物） ×6 mL

• 样品稀释液 ×6 mL

• 显色剂A液 ×6 mL

• 显色剂B液 ×6 mL

• 终止液 ×6 mL

• 20×浓缩洗涤液 ×25 mL

96孔配置：同48孔配置，各组分数量加倍。
保存条件：2-8℃保存，有效期12个月，避免反复冻融和直接光照。

五、注意事项

1. 实验前将所有试剂及样本恢复至室温（18-25℃）并充分混匀。

2. 高脂或溶血样本可能影响结果，建议稀释后检测。

3. 试剂瓶盖需密闭，防止蒸发或污染。

4. 显色剂A/B需避光保存，按需现配现用。

六、操作步骤

1. 准备：试剂及样本恢复至室温，配置洗涤液（1×PBST）。

2. 标准品加样：向标准品孔加入50 μL梯度稀释的KYN标准品。

3. 样本加样：向样本孔加入50 μL待测样本，同时加入50 μL酶标试剂（KYN-BSA-HRP）。

4. 竞争反应：轻摇混匀，封板膜封板，37℃恒温箱孵育1小时。

5. 洗涤：弃去液体，洗板5次（每孔300 μL洗涤液），拍干。

6. 显色：每孔加入50 μL显色剂A和50 μL显色剂B，避光显色15分钟。

7. 终止：每孔加入50 μL终止液，立即于450 nm波长测定OD值。

七、试验所需自备物品

• 酶标仪（450 nm/620 nm双波长）

• 高精度移液器（2-200 μL）及滤芯吸头

• 37℃恒温箱

• 离心机（≥12000 rpm）

• 蒸馏水或去离子水

• 吸水纸

八、结果判断与分析

1. 绘制标准曲线：以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，使用四参数逻辑回归拟合曲线（R²＞0.99）。

2. 计算样本浓度：根据样本OD值，从标准曲线上查得对应KYN浓度（竞争法中OD值与浓度呈负相关）。

3. 数据分析：推荐使用GraphPad Prism或SPSS进行统计分析，比较组间差异（如t检验或ANOVA）。